CÔNG KHAI THÔNG TIN NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NĂM 2024
1. Tên nhiệm vụ: Bảo tồn nguồn gen lan Đai Châu (Rhynchostylis gigantea) phân bố ở rừng An Lão tỉnh Bình Định
2. Tên chủ nhiệm nhiệm vụ: Lê Đức Dũng
3. Các thành viên thực hiện chính, thư ký khoa học: Nguyễn Thị Diễm Thúy, Nguyễn Trường Giang, Nguyễn Minh Lý, Bùi Thị Vĩ Thảo, Văn Thế Vinh, Hồ Trúc Nhã, Nguyễn Quang Hải.
4. Mục tiêu của nhiệm vụ:
Mục tiêu tổng thể:
Thu thập và bảo tồn được nguồn gen lan Đai Châu phân bố ở rừng An Lão tỉnh Bình Định (Rhynchostylis gigantea)
Mục tiêu cụ thể:
- Điều tra, thu thập và xây dựng được bảng mô tả các tính trạng đặc trưng của nguồn gen lan Đai Châu phân bố ở rừng An Quang, An Trung và An Dũng của huyện An Lão tỉnh Bình Định.
- Tư liệu hóa và bảo tồn ngoại vi được nguồn gen lan Đai Châu phân bố ở rừng An Lão tỉnh Bình Định; quy mô giống được bảo tồn 50 cá thể.
- Xây dựng bộ dữ liệu mã vạch DNA lan Đai Châu phân bố ở rừng An Lão – Bình Định.
5. Các nội dung nghiên cứu khoa học:
* Nội dung 1: Điều tra, thu thập, xây dựng bảng mô tả các tính trạng đặc trưng và bảo tồn nguồn gen lan Đai Châu phân bố ở rừng An Lão tỉnh Bình Định
Công việc 1.1: Điều tra, thu thập nguồn gen lan Đai Châu phân bố ở rừng An Lão, tỉnh Bình Định.
- Địa điểm điều tra thu thập: Xã An Quang, An Trung và An Dũng, Huyện An Lão, tỉnh Bình Định.
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 02/2024 - 6/2024.
- Quy mô: 3 xã x 3 tuyến/xã x 3 ô/tuyến
- Nội dung điều tra:
+ Điều tra phân bố lan Đai Châu ở rừng các xã An Quang, An Trung và An Dũng, An Lão, tỉnh Bình Định.
+ Điều tra một số đặc điểm sinh học và sinh thái học của lan Đai Châu phân bố ở rừng An Lão, tỉnh Bình Định
- Phương pháp nghiên cứu
Điều tra phân bố lan Đai Châu ở rừng An Lão, tỉnh Bình Định
- Bước 1. Thu thập số liệu thông qua các tài liệu thứ cấp
+ Thu thập tài liệu thứ cấp về hiện trạng rừng, phân bố lan Đai Châu ở rừng các xã An Quang, An Trung và An Dũng, huyện An Lão, tỉnh Bình Định.
+ Sơ bộ lập các tuyến, ô tiêu chuẩn trên bản đồ hiện trạng và xác định vị trí địa lý trên bản đồ làm căn cứ lập tuyến và OTC trên thực địa.
- Bước 2. Lập các tuyến và các ô tiêu chuẩn điều tra
+ Tiến hành lập các tuyến và OTC trên thực địa. Sử dụng GPS để thiết lập các tuyến, OTC trên thực địa theo tọa độ đã được thiết lập trên bản đồ, kết hợp điều chỉnh tọa độ cho phù hợp với địa hình thực tế.
+ Tuyến điều tra được thiết kế qua các trạng thái rừng và qua các điều kiện tự nhiên phân hoá khác nhau như dạng địa hình, độ cao.
+ Điều tra theo hệ thống ô mẫu điển hình (OTC trong điều tra lâm học), OTC có diện tích 1.000m2được lập trên các tuyến khảo sát.
+ Chiều dài mỗi tuyến từ 2 – 16 km, tùy thộc vào vị trí và địa hình, độ dốc.
+ Số lượng ô tiêu chuẩn điều tra được lập là 27 ô tiêu chuẩn (lập 3 OTC trên 1 tuyến điều tra)
+ Các chỉ tiêu điều tra được ghi theo mẫu dưới đây.
Danh lục lan Đai Châu phân bố ở rừng An Lão
- Tuyến số………… Kiểu rừng………
- OTC............................Trạng thái rừng........................
- Độ cao .................. Kinh độ..................Vĩ độ .................................
- Ngày điều tra ..................Độ dốc .............Hướng phơi.......................
TT | Nguồn gốc tái sinh | Dạng sống | Cây chủ | Chất lượng cây |
Tốt | T.bình | Xấu |
1 | | | | | | |
2 | | | | | | |
3 | | | | | | |
* Thu thập mẫu và mô tả một số đặc điểm sinh học và sinh thái học
- Phương pháp quan sát mô tả:
+ Chọn những cây phát triển tốt, trưởng thành để điều tra (5 cây), mô tả hình thái rễ, thân, lá, hoa và quả (nếu có).
+ Quan sát bằng mắt trạng thái vật hậu trong quá trình điều tra thực địa, sự biến đổi các bộ phận (nhánh, chồi, hoa, quả).
- Phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu vật
+ Trên các tuyến và OTC tiến hành, thu hái mẫu (thu hái ít nhất 5 mẫu) và phải xác định vị trí lấy mẫu bằng máy định vị GPS. Cách thu hái mẫu các loài Lan như sau:
+ Lan là loài cây sống nhờ, sống bám, cây hoại sinh, dùng dao nhỏ hay cưa cắt lấy cả một phần cây chủ.
+ Trong các mẫu được thu thập, chọn và xử lý một mẫu thể hiện được đặc trưng của loài, tiến hành chụp ảnh.
+ Thu hái mẫu và chụp ảnh sẽ được lập hồ sơ mô tả một số đặc điểm cơ bản thực vật cùa loài để phục vụ cho việc phân tích, giám định.
+ Mỗi một mẫu đều được gắn một nhãn riêng. Nhãn là một bản giấy ép lastic hình chữ nhật dài khoảng 5 – 6cm, rộng khoảng 3cm, ở đầu có đính chỉ để buộc vào mẫu vật. Nội dung của nhãn ghi: số hiệu mẫu; ngày thu hái mẫu; người thu hái mẫu.
+ Mỗi một số hiệu mẫu đều được kèm theo bản/phiếu mô tả các đặc điểm hình thái riêng. Phiếu mô tả là bản ghi lại các thông tin có liên quan đến cây được thu thập.
Sản phẩm:
- Báo cáo kết quả điều tra, thu thập nguồn gen Lan Đai châu phân bố ở rừng An Lão, tỉnh Bình Định.
- Thu thập ít nhất 5 cá thể lan Đai Châu ở rừng An Lão.
Công việc 1.2: Xây dựng bảng mô tả các tính trạng đặc trưng của giống lan Đai Châu phân bố ở rừng An Lão tỉnh Bình Định đã thu thập.
Bảng các tính trạng đặc trưng của giống lan Đai Châu được xây dựng dựa trên nghiên cứu của Anuttato và ctv. (2017) (Phụ lục F).
* Điều tra thu thập thông tin các tính trạng đặc trưng của giống
- Địa điểm điều tra: Tại các xã, thị trấn thuộc huyện An Lão.
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2024 - 12/2024.
- Số lượng: 50 mẫu phiếu.
- Phương pháp: Lựa chọn các địa phương, các điểm có hộ nuôi trồng lan Đai Châu để tiến hành điều tra, chọn 50 người có nhiều kinh nghiệm trong nuôi trồng lan. Cán bộ điều tra tiến hành phỏng vấn trực tiếp theo các nội dung trong phiếu điều tra. Sau đó, tiến hành mời 50 người trực tiếp nhận diện giống lan Đai Châu thông qua quan sát hình thái lá, bông... Dựa trên các thảo luận trực tiếp và các số liệu thu thập trực tiếp để làm căn cứ xây dựng Bảng các tính trạng đặc trưng của giống lan Đai Châu phân bố ở rừng huyện An Lão – Bình Định.
* Thu thập mẫu giống phục vụ xây dựng bảng mô tả các tính trạng đặc trưng
- Địa điểm thu thập: Tại huyện An Lão.
- Thời gian: Từ tháng 01/2024 – 12/2024
- Quy mô: Tiến hành thu thập 45 cá thể từ các gia đình/nhà vườn nuôi trồng lan.
- Phương pháp: Sau khi thu thập, tiến hành trồng các mẫu giống theo dạng tập đoàn tại Viện KHKT Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ. Vào các giai đoạn sinh trưởng của cây lan, thu thập tất cả các số liệu về đặc điểm nông sinh học, tính chống chịu sâu bệnh và các tính trạng đặc biệt. Các số liệu đều được đo đếm trên 45 cá thể. Quá trình chọn 45 cá thể có tham khảo ý kiến của người nuôi trồng lan để chọn đúng giống nhằm thu thập số liệu cơ bản xây dựng Bảng các tính trạng đặc trưng của giống lan Đai Châu.
- Mỗi một mẫu đều được gắn một nhãn riêng, ghi các thông tin và nguồn gốc mẫu.
* Sản phẩm:
- 45 cá thể lan Đai Châu được thu thập
- Bảng mô tả các tính trạng đặc trưng của giống lan Đai Châu phân bố ở rừng An Lão - tỉnh Bình Định.
Công việc 1.3: Tư liệu hoá và bảo tồn ngoại vi loài lan Đai Châu An Lão
- Xây dựng vườn bảo tồn, lưu giữ 50 cá thể lan Đai Châu (5 cá thể thu thập từ trong rừng và 45 cá thể thu thập từ các gia đình/nhà vườn nuôi trồng lan).
- Chăm sóc, lưu giữ giống lan đã thu thập được.
- Địa điểm bảo tồn: Tại khu nhà lưới thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ.
- Theo dõi các đặc tính nông sinh học (18 tháng, từ tháng 6/2024 – tháng 10/2025).
- Tư liệu hoá quá trình điều tra, thu thập, mô tả và bảo tồn ngoại vi loài lan Đai Châu An Lão bằng số liệu, hình ảnh, báo cáo,…
* Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu mã vạch DNA lan Đai Châu phân bố ở rừng An Lão – Bình Định.
Công việc 2.1: Thu thập, xử lý mẫu lan Đai Châu An Lão.
- Địa điểm thực hiện: Huyện An Lão – Bình Định.
- Thời gian thực hiện: Tháng 01/2024 – tháng 06/2024.
- Số lượng: 5 cá thể x 2 mẫu/cá thể.
- Phương pháp nghiên cứu
+ Mẫu lá tươi của các cây lan Đai Châu từ rừng sẽ được thu, bảo quản trong túi đựng mẫu có chứa giấy thấm và silica gel, sau đó nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm, lưu trữ ở -20oC phục vụ nghiên cứu.
+ Số mẫu cần thu: 10 mẫu (5 cây x 2 mẫu/cây). Trung bình mỗi mẫu thu khoảng 50-100g lá tươi. Các mẫu sau khi thu thập sẽ được tiến hành tách chiết ADN ngay.
Công việc 2.2: Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá
- Địa điểm thực hiện: Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
- Thời gian thực hiện: Tháng /2024 – tháng 12/2024.
- Quy mô và số lượng mẫu: 30 mẫu (5 cây x 2 mẫu/cây x 3 lần thí nghiệm).
- Phương pháp nghiên cứu
+ Mẫu lá tươi sẽ được làm vật liệu trong nghiên cứu tách chiết DNA.. Tách chiết DNA tổng số từ lan Đai Châu được tiến hành theo phương pháp CTAB (Doyle J.J. và J.L. Doyle. 1987) với một số cải tiến theo quy trình như sau:
+ Phương pháp tách chiết AND: Dùng dao nhỏ cắt phần lá tươi từ 1,0 đến 2,0 mm. Lấy 300mg mẫu lá bổ sung vào 700µl dung dịch đệm CTAB (2% CTAB – Cetyltrimethylammonium Bromide; 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1,4M NaCl; 20mM EDTA, D-sorbitol), nghiền mẫu và ủ ở 65oC trong 60 phút; chuyển vào ống eppendorf.
+ Bổ sung 700µl hỗn hợp CI (24 chloroform/1 isoamyl alcohol), lắc nhẹ và để trong 10 phút, ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút;
+ Chuyển 600µl phần dịch nổi sau ly tâm trong sang ống eppendorf mới, bổ sung 600µl isopropanol, lắc nhẹ, ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút, thu kết tủa;
+ Rửa kết tủa bằng ethanol 70% hai lần khi ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi, sấy khô;
+ Kết tủa DNA được hòa loãng trong 100µl nước cất vô trùng và được bảo quản trong điều kiện -20oC cho đến khi sử dụng.
+ Yêu cầu: Tách chiết thành công mẫu DNA tổng số từ các mẫu giống lan Đai Châu trong nghiên cứu đảm bảo mẫu DNA đạt nồng độ và độ tinh sạch cao phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
Công việc 2.3. Xác định, thiết kế các mồi và khuếch đại các vùng bảo thủ (mã vạch DNA) lan Đai Châu An Lão
- Địa điểm thực hiện: Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
- Thời gian thực hiện: Tháng 06/2024 – tháng 12/2024.
- Phương pháp nghiên cứu
+ Tham khảo các tài liệu liên quan, xác định ít nhất từ 02 đến 10 gen phù hợp trong nghiên cứu di truyền. Thiết kế mồi, khuếch đại vùng gen nghiên cứu bằng phương pháp PCR.
+ Yêu cầu: lựa chọn thiết kế được 02-10 cặp mồi phù hợp phục vụ đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống nghiên cứu. Thu nhận các sản phẩm PCR có độ đặc hiệu và tinh sạch cao phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
+ Căn cứ vào khả năng khuếch đại từng vùng trình tự với các cặp mồi lựa chọn ra các mồi phù hợp.
+ Phương pháp khuếch đại vùng trình tự bảo thủ bằng PCR: Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích 20µl có chứa 1X Master Mix; 0,5 pmol mồi xuôi và ngược; 80-100 ng DNA. Quá trình khuếch đại DNA được tiến hành trên máy Aeris Thermal Cycler (ESCO, Singapore) với chu trình nhiệt bao bắt đầu ở 95oC trong 3 phút; tiếp theo 30 chu kỳ với 95oC trong 30 giây, 39-55oC trong 30 giây tùy thuộc vào trình tự đoạn mồi sử dụng, 72oC trong 30 giây, và kết thúc ở 72oC trong 5 phút.
+ Để đánh giá chất lượng của DNA tổng số và sản phẩm PCR được thực hiện trên thiết bị điện di ngang (MultiSUB Midi, Cleaver Scientific- England) với nồng độ gel Agarose 1%; 1X bộ đệm TBE; 100V; 100mA trong 70 phút. Kết quả điện di được quan sát thông qua máy soi mẫu (MS UVDI). Trong đó, Các mẫu được đối sánh với thang chuẩn (HyperLadder 1kb) để đánh giá về chất lượng và kích thước thông qua băng DNA.
Công việc 2.4. Giải trình tự mã vạch DNA
- Địa điểm thực hiện: Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
- Thời gian thực hiện: Tháng 01/2025 - tháng 06/2025.
- Giải trình tự các đoạn gen nghiên cứu.
- Phương pháp nghiên cứu
+ Giải mã các sản phẩm PCR (2 chiều): Trình tự đoạn nucleotide quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang sử dụng BigDye Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit. Phản ứng được thực hiện với thành phần để khuếch đại DNA cho việc đọc trình tự bao gồm: mồi (thích hợp) 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tích 15 µl; Chu trình nhiệt cho PCR trong máy GenAmp® PCR System 9700 như sau: 96ºC - 1 phút; (96ºC - 10 giây; 50ºC - 5 giây; 60ºC - 4 phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩm được giữ ở 4ºC.
+ Yêu cầu: Giải mã sản phẩm PCR đảm bảo giải mã 2 chiều thu nhận đầy đủ thông tin của các mẫu trình tự các vùng gen nghiên cứu; Phân tích các trình tự thu nhận bằng các phần mềm tin học phù hợp.
Công việc 2.5. Xử lý dữ liệu trình tự DNA và công bố dữ liệu mã vạch DNA trên ngân hàng gen (GenBank – NCBI).
- Địa điểm thực hiện: Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
- Thời gian thực hiện: Tháng 01/2025 – tháng 8/2025.
- Phương pháp phân tích các trình tự đã giải mã bằng BLASTN trên ngân hàng GeneBank NCBI. Đăng ký các trình tự gen đặc thù lên ngân hàng gen NCBI.
Công việc 2.6. Xác định mối quan hệ di truyền của lan Đai Châu bằng phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loài dựa trên mã vạch DNA
- Địa điểm thực hiện: Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
- Thời gian thực hiện: Tháng 01/2025 – tháng 8/2025.
- Phương pháp:
+ Thống kê, xử lí số liệu, viết báo cáo về định danh, xây dựng cây quan hệ di truyền của lan Đai Châu An Lão.
+ Xử lí số liệu và xây dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm MEGA6. Trình tự sau khi hiệu chỉnh sẽ được phân tích và xây dựng cây phát sinh loài nhằm mô tả mối quan hệ giữa các loài dựa trên phần mềm MEGA 11 (version 11.0.13), thuật toán Maximum likelihood, theo mô hình Kimura 2-thông số.
+ So sánh trình tự nghiên cứu trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để định danh tên khoa học của nguồn gen lan Đai Châu.
* Hội thảo khoa học
- Số lượng: 01 hội thảo (20 người)
- Thời gian: Tháng 10/2025
- Đối tượng: Đại diện Sở Nông nghiệp và PTNT, Sở Khoa học và Công nghệ, Chi cục TT-BVTV, Trung tâm Khuyến nông, Liên Hiệp hội Khoa học và Kỹ thuật, Hội Làm vườn, Hội Sinh vật cảnh, Đại học Quy Nhơn, Viện KHKT Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ, Phòng Nông nghiệp và PTNT An Lão, Trung tâm Dịch vụ NN An Lão, chính quyền một số xã và đại diện người chơi lan Đai Châu An Lão có nhiều kinh nghiệm.
- Địa điểm: Tại TP. Quy Nhơn.
- Nội dung: Giới thiệu các kết quả đạt được của đề tài để các đại biểu tham dự hội thảo tham gia thảo luận và đóng góp ý kiến nhằm giúp cơ quan chủ trì hoàn thiện báo cáo tổng kết đề tài, các phương pháp, bảo tồn cây lan Đai Châu.
6. Thời gian thực hiện: 24 tháng, Từ tháng 12/2023 đến tháng 12/2025
7. Phương thức khoán chi: Khoán từng phần;
8.Tổng số kinh phí thực hiện: 497.693.000 đồng
- Kinh phí từ NSNN: 497.693.000 đồng
+ Kinh phí khoán: 334.212.000 đồng
+ Kinh phí không khoán: 163.481.000 đồng